Микроскопическая диагностика грибковых заболеваний. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний

Согласно инструкции СП 1.2.036-95 Госкомэпиднадзора РФ, Москва, 1996 г. "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности” по эпидемиологической опасности дрожжевые и плесневые грибы, а также дерматофиты относятся к III-IV группам возбудителей инфекционных болезней, поэтому при работе с ними необходимо соблюдать особые правила техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены, направленные на обеспечение личной и общественной профилактики заражения, аллергизации и распространения инфекции.

Лаборатория для работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности укомплектовывается легко дезинфицирующейся мебелью, включая шкафы для чистой лабораторной посуды, реактивов, питательных сред, соответствующим оборудованием и инструментами. Для работы необходимы спиртовки или газовые горелки, микробиологические петли, микологические лопаточки, шпатели, эпиляционные и анатомические пинцеты, кусачки маникюрные, скальпели, ножницы, ложечки Фолькмана, пипетки, пастеровские пипетки, иглы препаровальные, стеклянные палочки, шприцы, низкоскоростная центрифуга, аппарат для встряхивания, чашки Петри, пробирки, стеклянная посуда, ультрафиолетовая лампа Вуда с фильтром, микроскопы, осветители, термостаты, автоклавы, холодильники, сухожаровые шкафы, бактерицидные лампы.

Взятие материала для исследования

Микроскопическая диагностика микозов подразумевает обнаружение мицелия и спор в исследуемом биоматериале. В качестве исследуемого биоматериала рассматриваются чешуйки эпидермиса, волосы и ногти. Непременным требованием перед проведением исследования является отсутствие местного лечения в течение, как минимум, десяти дней и системного лечения – в течение месяца. Следует иметь в виду, что использование пациентом моющих средств (особенно содержащих антисептики) способно повлиять на достоверность результатов исследования, поэтому за 3-4 дня до его проведения запрещают мытьё.

Инструментарий для взятия биоматериала и приготовления препарата представлен на рисунке:

Фото. Инструментарий для взятия биоматериала и приготовления препарата.

При подозрении на микоз гладкой кожи, микоз кистей и стоп без поражения ногтевых пластинок исследуются чешуйки эпидермиса с поверхности очага поражения. При микозе гладкой кожи является предпочтительным исследование эпидермиса с краевой зоны очага поражения, так как в центральной зоне патологический процесс нередко разрешается. При этом не следует забывать о возможности поражения пушковых волос, что определяет выбор дальнейшей тактики лечения. Волосы извлекают эпиляционным пинцетом. При микозе кистей и стоп без поражения ногтевых пластинок исследуются чешуйки эпидермиса из третьей и четвертой межпальцевых складок, а также с ладоней и со свода стоп.

При подозрении на грибковое поражение длинных волос (волосистой части головы, бороды, усов и лобка), а также пушковых волос выполняется их микроскопическое исследование. При трихофитии волосистой части головы волосы обламываются на расстоянии 1-2 мм над уровнем устья волосяного фолликула, напоминая при этом пеньки и точки. Если волос не удаётся захватить эпиляционным пинцетом, то в этом случае его стараются извлечь острым концом скальпеля или препаровальной иглой.

При микроспории волосистой части головы волосы обламываются на высоте 5-6 мм, напоминая «скошенный луг». При микроскопии исследуются именно эти обломанные волосы. Волосы из очагов поражения извлекают с помощью пинцета.

При фавусе исследуют истончённые волосы над поверхностью скутулы.

При подозрении на онихомикоз исследуется легко измельчающийся материал из зоны подногтевого гиперкератоза, а также сами измененные ногтевые пластинки.

Необходимо понимать, что любой исследуемый материал от пациента потенциально заразен, поэтому его взятие необходимо осуществлять в помещении, где осуществляется ежедневная влажная уборка с применением дезинфицирующих средств (5% раствор хлорамина, 5% осветленная хлорная известь), а воздух стерилизуется ультрафиолетовыми облучателями (их включают на 1-1,5 ч и входят в помещение через 20 мин после выключения). Термостаты еженедельно протирают 0,5% раствором хлорамина, стены обрабатывают дезсредствами 1 раз в месяц. Врач при работе должен быть защищён маской, защитными очками, халатом и перчатками. Инструментарий для взятия биоматериала, перчатки, предметные и покровные стёкла, одноразовые пелерины и салфетки обеззараживают после использования, погружая в 1,5% раствор клиндезина-экстра (5% раствор фенола или 5% раствор лизола) на 30 минут. Оставшийся патологический материал (волосы, кожные и ногтевые чешуйки) автоклавируют при 2 атм. и 132˚ С в течение 20 мин (контроль - мочевина) или при 1,5 атм. и 126˚ С в течение 30 мин (контроль - бензойная кислота), либо кипятят 1 час в воде или 30 мин в 1% мыльно-содовом растворе.

Патологический материал транспортируют в лабораторию в специальной таре или металлических биксах, защищая его от прямых солнечных лучей. В сопроводительном документе указывают фамилию, имя, отчество, пол, возраст и адрес больного, предполагаемый клинический диагноз, наименование исследуемого материала, время его взятия, локализацию очага, номер истории болезни, фамилию врача и учреждение, направляющее материал.

Приготовление препарата

После получения чешуек эпидермиса с очага поражения производится приготовление препарата для микроскопического исследования. На исследуемый материал, помещенный на предметное стекло, наносят 1-2 капли 20% КОН, после чего предметное стекло подогревают над пламенем горелки до появления белесоватого ободка кристаллизованной щелочи по периферии. Затем препарат накрывают покровным стеклом (которое придавливают препаровальной иглой) и микроскопируют. Исследование необходимо проводить не позднее 2-х часов после приготовления препарата из-за возможности кристаллизации щёлочи.

Способ приготовления препарата волоса при подозрении на его грибковое поражение соответствует ранее описанному, с той лишь разницей, что покровное стекло не придавливается препаровальной иглой (во избежание раздавливания волоса).

Фото. Появление ободка кристаллизованной щелочи.

Для приготовления препарата кусочки срезанных ногтевых пластинок опускают в пробирку с 20% КОН и экспонируют в термостате в течение 1 часа (t≈37˚C), а затем получившуюся желеобразную массу переносят на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют под микроскопом.

В отличие от ногтевых пластинок образцы из легко измельчающегося материала зоны подногтевого гиперкератоза помещают на предметное стекло, на них наносят 1-2 капли 20% КОН, после чего предметное стекло подогревают над пламенем горелки до появления белесоватого ободка кристаллизованной щелочи по периферии (рис.65). Затем препарат накрывают покровным стеклом, которое осторожно придавливают препаровальной иглой, и исследуют под микроскопом.

Микроскопия препарата

Для проведения микроскопического исследования используют лабораторный микроскоп без применения иммерсии. Микроскопия чешуек эпидермиса, чешуек из зоны подногтевого гиперкератоза, а также растворенных ногтевых пластинок производится вначале на малом увеличении (×100), а при обнаружении нитей мицелия, напоминающих «карту рек» (железных дорог), объектив переводится на бȯльшее увеличение (×400). Мицелий на среднем увеличении напоминает причудливой формы стеклянные палочки, изменяющие степень преломления света при работе микровинтом микроскопа.

Микроскопия препарата волоса производится сразу на среднем увеличении (×200 или ×400). При трихофитии внутри волоса обнаруживаются крупные споры, расположенные рядами, тогда как при микроспории внутри волоса имеется множество мелких мозаично расположенных спор (отсюда термин «микроспория»). Иногда отмечают наличие чехлика снаружи волоса – это характерно для как трихофитии (вариант ectothrix, споры при этом крупные), так и для микроспории (в этом случае чехлик состоит из мелких спор). При микроскопии пораженных волос при фавусе, внутри волоса кроме скоплений спор круглой или многоугольной формы, обнаруживаются пузырьки воздуха и нити мицелия.

Препараты необходимо просмотреть не позднее 2 часов с момента их приготовления из-за возможности кристаллизации щелочи. Для повышения надежности диагностики следует сделать несколько препаратов (не менее двух) из одного очага поражения. Возможные ошибки при микроскопической диагностике микозов могут быть связаны как с некачественным приготовлением препаратов (перегревом над пламенем горелки, что сопровождается преждевременной кристаллизацией щелочи), а также с недостаточным опытом исследователя (когда за нити мицелия нередко принимают волокна ткани, случайно оказавшейся в препарате).

По данным ученых, симптомы микоза стоп имеются у 70% населения Земли. При этом заболевании страдают межпальцевые складки и кожа на подошвах. Причиной болезни является грибок, который вначале встречался лишь в ограниченных районах юго-востока Азии и в Африке. Первая мировая война, вызвав массовую миграцию населения и ухудшение санитарных условий, привела к распространению болезни по всему миру.

Что провоцирует микоз стоп

Основной возбудитель болезни - Trichophyton rubrum. Поражение могут вызвать T. mentagrophytes и Epidermophyton floccosum. Значительно реже патогенными микробами могут стать грибки рода Candida и плесневые микроорганизмы.

Наиболее значимые факторы риска заболевания:

сахарный диабет;
иммунодефицитное состояние (СПИД);
плоскостопие;
атеросклероз периферических артерий;
варикозная болезнь вен нижних конечностей.

Внешние условия, способствующие развитию инфекции:

закрытая негигроскопичная обувь;
травмы стопы (мозоли, потертости);
занятия спортом.

Симптомы микоза стопы чаще всего бывают у взрослых мужчин. Дети болеют редко.

Симптомы микоза стоп

При развитии заболевания появляется шелушение и сухость кожи, зуд и жжение, особенно в межпальцевых промежутках, появление болезненных трещин под пальцами. Иногда первые симптомы микоза стопы – пузырьки, лопающиеся с образованием эрозий. Часто болезнь протекает в стертой форме, проявляясь лишь небольшим шелушением, напоминающим муку, в складках между пальцами.

Существует 4 клинических формы заболевания.

Межпальцевой, или интертригинозный вариант, - самый частый. Кожа между пальцами краснеет, трескается, поверхностный слой мокнет и шелушится. Эти признаки распространяются на подошву, сопровождаются сильным зудом и жжением. Нередко присоединяется бактериальное воспаление.

Сквамозно-гиперкератотический вариант связан с выраженным утолщением и растрескиванием кожи. Подошва краснеет и шелушится. В области пяток появляются глубокие болезненные трещины, зуд обычно нехарактерен. Часто это двустороннее поражение, его еще называют «мокасиновой стопой».

Дисгидротический вариант сопровождается возникновением множественных мелких зудящих болезненных пузырьков. Они сливаются друг с другом, образуя крупные пузыри. Покрышки пузырей лопаются, обнажая блестящую ранимую болезненную поверхность – эрозию. Внешние проявления напоминают экзему.

Нередко присоединяется микробное воспаление с увеличением паховых лимфоузлов, лихорадкой, болью в ноге, тошнотой, головной болью и другими признаками интоксикации. При дисгидротическом виде часто возникает аллергия на грибки – микотическая экзема. Она сопровождается высыпаниями на участках тела, не зараженных грибком, например, на кистях.

Стертый вариант обычно протекает незаметно. Он сопровождается небольшим шелушением кожи между большим и указательным и/или безымянным и мизинцем на ноге. Зуд отсутствует.

Признаки микоза стоп

Разные виды микоза стоп могут быть самостоятельными заболеваниями или протекать как часть общего грибкового поражения организма. Иногда возникает признак «две стопы – одна кисть» с вовлечением этих органов. Может присоединяться онихомикоз – грибковое разрушение ногтя. Иногда одновременно страдают паховые складки.

Основные симптомы и лечение микоза стопы представлены на фото:

Шелушение кожи

Сухость и растрескивание кожи

Пузырьки и эрозии

Диагностика

Распознать различные виды микоза стоп опытный врач-дерматолог может во время первого осмотра. Однако для подтверждения диагноза необходимо микроскопическое исследование. Для него используют чешуйки из очага поражения, соскребенные с помощью шпателя и обработанные раствором щелочи. Полученный материал рассматривают под микроскопом и обнаруживают возбудителей.

Метод прямой микроскопии быстрый, дешевый и простой в выполнении, но не позволяет определить, какой вид грибка вызвал заболевание. Поэтому проводится посев материала на питательную среду с последующим культуральным исследованием полученного материала. Однако получить культуру грибка после обнаружения его под микроскопом удается лишь в 20 – 6о% случаев.

Виды лечения микоза стоп

Препараты для терапии грибковых заболеваний должен назначить врач-дерматолог. Обычно лечение микоза стопы проводят с помощью наружных средств.

Один из эффективных препаратов при этом заболевании – клотримазол. В нашем магазине вы можете купить его по невысокой стоимости. Лекарственное средство в форме лосьона Клотримазол для ногтей и кожи подавляет размножение грибков в толще рогового слоя эпителия. При поражении межпальцевых складок лосьон наносят ежедневно на чистую сухую кожу стоп в течение недели, при необходимости дольше.

При выраженном ороговении и растрескивании кожи вначале необходимо устранить омертвевшие кожные наложения. Для этого необходимо использование отшелушивающих медикаментов. Например, назначают салициловую мазь, кремы с молочной кислотой или мочевиной. После удаления роговых отложений лосьон применяют 1 – 2 раза в день.

При дисгидротическом варианте на первом этапе нужно уменьшить мокнутие. Для этого используются примочки с танином или борной кислотой. В тяжелых случаях к лечению добавляют глюкокортикоидные средства. Затем применяют лосьон Клотримазол по обычной схеме.

При стертой форме стопы обрабатывают лосьоном 1 раз в день в течение 7 – 10 дней, но длительность курса индивидуальна и определяется врачом.

Системная терапия

При длительном или рецидивирующем микозе стоп может потребоваться прием противогрибковых препаратов внутрь. Они попадают из желудочно-кишечного тракта в кровоток, а затем в кожу, где уничтожают грибки. Используются три основных препарата:

флуконазол;
итраконазол;
тербинафин.

Длительность приема этих средств составляет не менее месяца. Их цена довольно высока. Поэтому предупредить микоз стопы всегда проще и выгоднее, чем его вылечить.

Системные препараты особенно часто назначаются, если грибок поразил не только кожу, но и ногти. В этом случае лекарства накапливаются в отрастающей части ногтевой пластинки, и постепенно отрастает здоровый ноготь. Для улучшения эффекта ноготь могут полностью удалить хирургическим путем, после чего он восстанавливается уже без грибка.

Сочетание удаления ногтя, системной и местной противогрибковой терапии особенно часто бывает необходимо у пожилых пациентов. В этой группе пациентов нередко ногти растут медленно, кровообращение в стопах нарушено, поэтому для достижения эффекта требуется большая доза препаратов и длительный курс лечения.

Лечение народными средствами

Применение только рецептов народной медицины не поможет избавиться от грибка. Однако такое дополнение к обычной терапии сокращает курс лечения и ускоряет выздоровление.

Полезно каждый вечер делать теплые ванночки для ног в течение 10 минут, после чего тщательно промокнуть стопы полотенцем, особенно между пальцами, и нанести лечебный лосьон Клотримазол для ногтей и кожи. Полезные компоненты для ванн, снимающие воспаление и уменьшающие зуд:

трава чистотела и зверобоя;
корни лопуха;
трава полыни;
листья эвкалипта;
хвоя пихты;
свежая гуща от сваренного молотого кофе;
поваренная соль;
смесь из натертого хозяйственного мыла, пищевой соды, марганцовки и горчичного порошка.

Пораженные места можно смазывать березовым дегтем или самостоятельно приготовленной мази из 100 граммов сливочного масла в смеси с растертой головкой чеснока. Полезен и прополис, который можно прибинтовывать к больным ногтям.

Полезно делать компрессы из натуральных средств. Сначала их оставляют на 1 – 2 часа, а при хорошей переносимости – на ночь. Используют такие ингредиенты:

мякоть тыквы;
измельченные семена черной редьки;
перечная мята, растертая с солью;
листья лопуха или рябины, слегка размягченные с помощью скалки.

Эффективно смазывание пораженных мест соками некоторых растений и других натуральных средств:

спиртовый раствор прополиса;
луковый или чесночный сок;
сок чистотела;
масло чайного дерева.

Профилактика заболевания

Для того чтобы избежать микоза или предотвратить его рецидив, нужна простая, но постоянная профилактика:

летом носить воздухопроницаемую обувь из натурального материала;
при посещении бассейнов, бань, общественных душевых надевать индивидуальные резиновые тапочки;
не надевать чужую обувь, например, в гостях;
использовать только собственные приборы гигиены – ножницы, пемзу, пилку для ногтей.

Чтобы избежать повторного заражения, стельки и внутреннюю поверхность обуви нужно регулярно обрабатывать дезинфицирующими средствами. Известный народный рецепт – раствор уксусной эссенции, однако он имеет резкий неприятный запах.

Врачи рекомендуют применять препарат Микоспрей, обладающий не только противогрибковым, но и антибактериальным действием. Микоспрей отлично подходит не только для обработки обуви, но и для нанесения на ноги перед посещением общественных мест для защиты стоп.

Приобрести препараты для лечения микоза стопы и для его профилактики жители Москвы и регионов могут в нашем интернет-магазине. Они имеют доказанную эффективность и безопасность. Их использование рекомендуется всем людям, которые не хотят заразиться грибком стопы или быстро избавиться от него.

Основными в этиологической лабораторной диагностике микозов до настоящего времени продолжают оставаться классические методы, включающие микроскопию материала, выделение чистой культуры возбудителя с последующей его идентификацией. Иммунологические методы диагностики имеют вспомогательное значение. Они используются для выявления наиболее значимых возбудителей: патогенных диморфных грибов, а также возбудителей криптококкоза, кандидоза и аспергиллеза. Методы геноиндикации (полимеразная цепная реакция) также имеют ограниченное применение ввиду их недостаточной специфичности, но применяются преимущественно при диагностике глубоких и оппортунистических микозов.

Материалом для исследования при лабораторной диагностике микозов в зависимости от формы заболевания могут быть: кожа и ее придатки (волосы, ногти), отделяемое ран и свищей, мокрота, кровь, ликвор и моча, тканевые биоптаты. Правильностью взятия патологического материала во многом определяется эффективность дальнейшего лабораторного исследования. При кожных поражениях материал отбирается чаще всего методом соскобов или с использованием липкой ленты (преимущественно при поверхностных формах) до лечения из свежих, но полностью развившихся очагов по периферии, где находятся наиболее жизнеспособные возбудители.

При выявлении грибов-дерматофитов чрезвычайно информативным материалом являются волосы, поскольку характер поражения волос позволяет идентифицировать возбудителя. Определению очага поражения в ряде случаев помогает использование лампы Вуда. Пораженные волосы вместе с чешуйками извлекаются эпиляционным пинцетом. При хронической черноточечной трихофитии волосы извлекают из кожи препарировальной иглой.

Ногти отбирают на протяжении всех слоев, срезая острым скальпелем или ножницами. Более эффективен отбор с использованием зубного бура. При кандидозных поражениях материал отбирается с помощью соскоба с ногтевого валика. Отобранный материал доставляется в лабораторию в пакетах из темной бумаги, чтобы избежать высыхания и контаминации посторонней микрофлорой. Материал, содержащий гной, доставляется в стерильных бакпечатках или чашках Петри. Мокрота отбирается в стерильную посуду. Исследование мокроты должно быть проведено не позднее 2 ч после сбора. При удлинении сроков исследования образцы должны храниться в холодильнике при + 4 °С, в противном случае могут возникнуть диагностические ошибки, связанные с появлением псевдомицелиальных форм дрожжевых клеток.

Кровь и спинномозговая жидкость отбираются с соблюдением правил асептики. Посев крови осуществляется в жидкую среду Сабу- ро. Для исключения контаминации образцов крови проводят их повторные исследования. Спинномозговую жидкость центрифугируют, а осадок используют для микроскопирования и посева.

Моча отбирается утром в стерильную посуду, при этом необходимо избегать загрязнения материала микрофлорой кожи промежности. Посев мочи осуществляется с использованием количественных методов посева.

В диагностике микозов используются препараты как из нативного материала, так и окрашенные. При исследовании неокрашенных препаратов плотный материал предварительно просветляют (мацери- руют) 10-30% раствором КОН (можно использовать растворы диметил сульфоксида), а затем микроскопируют по методу «раздавленной капли». Для придания контрастности препараты прокрашивают водным раствором метиленового синего.

Окраску фиксированных мазков осуществляют различными способами: по Граму, метиленовым синим, по Романовскому - Гим- зе. Последний способ позволяет увидеть мелкие дрожжевые клетки и стадии фагоцитоза. Для криптококков используют окраску тушью, окраску с муцикармином по Саутгейту. Меланинсодержащие грибы (темноокрашенные), например Cladophialophora bandana , окрашивают по Массой - Фонтана (окраска меланина, входящего в состав клеточной стенки). Флюоресцирующие сыворотки используются при диагностике возбудителей глубоких микозов, возбудителей дерматофи- тии, грибов рода Candida.

Выделение чистой культуры возбудителя дает возможность установить родовую и видовую принадлежность гриба, изучить его свойства и чувствительность к антимикробным препаратам. Для выделения и идентификации грибов используют плотные и жидкие питательные среды Сабуро, сусло-агар. Эти среды обеспечивают рост большинства патогенных и условно-патогенных грибов. Кроме того среда Сабуро (рис. 8.2) стимулирует процессы пигментообразования у грибов, что имеет значение при идентификации.

Для подавления роста бактерий-контаминантов в среды добавляют антибиотики: левомицетин, стрептомицин, пенициллин, тетрациклин. Для выделения прихотливых патогенных грибов используют среды, обогащенные кровью и сердечно-мозговым экстрактом. Специальные среды используют для культивирования и идентификации грибов: среда Чапека - для формирования конидий при идентификации плесневых грибов, картофельный (картофельно-морковный) агар, рисовый агар - для выявления типов роста и получения хламидоспор при идентификации грибов рода Candida , морковный (овощной) агар - для получения типичных колоний культуры гриба Trichophyton schonleini, среда Кашкина - для выделения пигментообразующих грибов. Используются и дифференциально-диагностические среды, например, для идентификации С. albicans - хромогенные среды или среды, позволяющая определить фосфолипазную активность гриба.

Время инкубации грибов составляет от нескольких суток до 1 месяца и более. При подозрении на патогенные диморфные грибы для выдачи отрицательного ответа культивирование проводится в течение 8 недель.

Посевы проводят на среды, разлитые по пробиркам, флаконам и чашкам Петри. Посевы материала на грибы-дерматофиты осуществляют одновременно на несколько пробирок со средой. Материалы, подозрительные на содержание плесневых грибов (мокрота), засевают в 3 точки и инкубируют при 28 и 37 °С. Для решения вопроса об отсутствии контаминации при заборе материала осуществляют контрольные посевы воздуха на содержание плесневых грибов в помещениях лаборатории и палатах, где находятся больные.

При культивировании грибов в микологической лаборатории соблюдаются меры безопасности, аналогичные таковым в бактериологических лабораториях. Работу с плесневыми грибами и микотоксинами во избежание аллергизации персонал проводит в боксированных помещениях в марлевых повязках или в настольных боксах с вытяжкой. Работа с культурами, относящимися ко II группе патогенности (патогенные диморфные грибы), возможна только в специализированных лабораториях.

Идентификация видов грибов проводится на основании комплекса культуральных, морфологических и других признаков. К первым относятся морфология колонии, ее окраска и размеры при культивировании на специальных средах, строение края и центра, характер поверхности, наличие и характер репродуктивных органов, ко вторым - особенности микроскопического строения мицелия, строение, форма и размеры репродуктивных органов - конидиеносцев, конидий, хламидоспор, артроспор и т.д.

Грибы формируют различные типы колоний на плотных питательных средах. Ученые из института Г. Вентера (США), учитывая способность грибов выделять в среду пигментные вещества, создали в питательной среде «новогоднюю елку» (рис. 8.3).

Рис. 8.3. «Новогодняя елка» из грибов (верхушка: Talaromyces stipitatus ; дерево Aspergillus nidulans; украшения: Penicillium marneffei; пенек: Aspergillus terreus)

Ферментативные и ассимиляционные способности культур имеют большое значение при идентификации дрожжей (дрожжеподобных грибов). В настоящее время для идентификации часто встречающихся грибов - возбудителей заболеваний человека и животных - применяются коммерческие тест-системы: BBL Mycotube, API 20С bio Merieux и др.

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА МИКОЗОВ

Взятие материала для лабораторного исследования на грибок.

1.ОСТ 42-21-2-854: приказ № 222/80 от 27.06.00
2.Оснащение: пинцет, предметные стекла, ножницы, ложка фолькмана.
4.Показания: грибковые заболевания.
5.Осложнения: нет.

Подготовка процедурного кабинета:

Смена растворов.

Приготовить:
-1%р-р хлорамина для ветоши
-3%р-р хлорамина – для дезинфекции перевязочного материала и пинцетов
- моющий р-р (156 мл. перекиси водорода + 5 г. моющего порошка + 839 мл. дисцилированной воды) - для обработки пинцетов
- 6% р-р перекиси водорода – для обработки перчаток.

Алгоритм выполнения манипуляции.

Нужно взять пинцет, предметное стекло, ложку фолькмана, ножницы;
- пациента пригласить в перевязочную;
- пациент сидит на стуле или кушетке;
- м/с стоит.

Техника выполнения:

Из очага поражения пинцетом взять чешуйки кожи и волосы;
- взятый материал положить на предметное стекло и закрыть другим предметным стеклом.
- вымыть руки с мылом;
- взятый материал отправить в лабораторию.

СБОР МАТЕРИАЛА

Взятие ногтей на исследование.

Взять ножницы и предметные стекла;
- ножницами отрезать кусочек от свободного края ногтя;
- взятый материал покрыть другим предметным стеклом;

Ножницы и пинцет замочить в 3% растворе формалина.

Правильный сбор материала из пораженных ногтей - залог успешного микробиологического исследования. Забирая материал, не всегда захватывают участки ногтя, содержащие жизнеспособные грибы. Нежизнеспособные грибы в культуре, естественно, не вырастут, и их вид установить не удастся.

Участок ногтя, который надо взять, определяется формой онихомикоза.

Так, при поверхностной форме онихомикоза следует делать соскобы с поверхности ногтевой пластинки.

При самой распространенной дистальной подногтевой форме наиболее жизнеспособные грибы располагаются под ногтевой пластинкой. Материал, который направляют на исследование, должен включать не только обрезок ногтевой пластинки, но и соскоб с ногтевого ложа, из-под пластинки.

Кроме того, следует захватывать и области неизмененного ногтя, поскольку на границе между ними и пораженными участками ногтя располагаются самые активные грибы.

При проксимальной подногтевой форме брать материал трудно. В этих случаях иногда, особенно если собираются проводить гистологическое исследование или дифференциальную диагностику, предпринимают биопсию ногтя, изредка используют бормашину.

При паронихиях делают соскобы с проксимального валика и из-под него.

Во всех случаях, чтобы избежать бактериальной контаминации, перед взятием образца следует обработать ноготь этиловым спиртом.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микроскопическое исследование патологического материала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах.

Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем самым делают грибы доступными для исследования.

На размягченные чешуйки кожи или ногтя, которые помещают на середину предметного стекла, наносят 1-3 капли 20 - 30% раствора КОН (NaOH). Исследуемый материал в каплях щелочи осторожно подогревают над пламенем спиртовки до появления нежного белого ободка из кристаллов щелочи по периферии капли. Подогревать до кипячения не следует. После подогревания каплю накрывают покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха.

Р. А. Аравийский и Г. И. Горшкова (1995) рекомендуют просветленные и накрытые покровным стеклом препараты кожных чешуек и волос оставлять на 5 - 10 мин, а ногтевых пластинок – на 30 - 40 мин до микроскопирования.

Просветление препаратов можно проводить без подогревания, для этого их оставляют в 20% растворе КОН на 30 - 60 мин или используют другие методы просветления патологического материала: хлораллактофенолом по Аману; лактофенолом; раствором, содержащим по 15% диметилсульфоксида и КОН в воде. Хорошие результаты получают после просветления ногтевых пластинок, помещенных в 5% раствор КОН на 24 ч, подогревания в этом случае не требуется.

Микроскопическое исследование производят на обычном лабораторном микроскопе без иммерсии.

Конденсор микроскопа должен быть опущен, диафрагма сужена. В начале препарат находят на стекле при малом увеличении (40х), последующее исследование производят при большем увеличении (100х);

детально препарат изучают при увеличении 400х. Необходимо исследовать несколько препаратов с тем, чтобы увеличить надежность анализа и избежать ложноположительных результатов.

Ошибки в микроскопической диагностике грибов могут возникнуть в связи как с дефектами приготовления препарата, так и с недостаточной опытностью лаборанта.

Дефекты изготовления прежде всего бывают связаны:
с перегреванием препарата, что может привести к выпадению кристаллов щелочи, разрушению волоса и появлению мелкозернистого распада в патологическом материале.

Линейное расположение удлиненных ровных кристаллов щелочи весьма напоминает нити септированного мицелия даже на чистом стекле без патологического материала.

Дифференциально-диагностическими признаками являются исключительное однообразие кристаллов, их стекловидная прозрачность, многогранность краев и отсутствие неразрывной связи одного элемента с другим. В сомнительных случаях рекомендуется добавить к препарату капельки слегка подогретой дистиллированной воды, которые быстро растворяют кристаллы щелочи.

За элементы гриба ошибочно могут быть приняты:

- капельки жира,
- пузырьки воздуха,
- хлопчатобумажные нити одежды
- и так называемый «мозаичный грибок».

Липиды кожных покровов, жировой распад клеток и зерна кератогиалина, особенно имеющие правильную форму, могут напоминать отдельные споры гриба. Но разнообразие формы и, главное, размеров, отсутствие внутренней структуры образований (вакуоли, оболочки) говорят против грибковой природы данных элементов. Липиды также могут попасть в препарат при взятии патологического материала с недостаточно очищенного очага поражения.

Пузырьки воздуха могут напоминать споры дрожжеподобных клеток, но в отличие от последних они окружены плотной темной оболочкой, и даже самые маленькие пузырьки воздуха всегда больше клеток гриба.

Нити от ткани носков, одежды и т. п. обычно лежат отдельно от патологического материала, они всегда больше гифов, грубее и не септированы.

«Мозаичный грибок» представляет собой артефакт, который возникает в процессе кристаллизации (возможно, за счет распада холестерина). Он имеет вид сеточки или петель, очертания которых соответствуют границам роговых чешуек, в отличие от нитей мицелия он никогда не пересекает стенки клеток эпидермиса.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раствором КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих темно-синих чернил фирмы Паркер (Parker"s Superchrome Blue-Black Ink).

При этой окраске гифы и споры окрашиваются в голубой цвет.

При микроскопии обнаруживают нитевидные гифы грибов или почкующиеся клетки (рис.1).

Таким образом, микроскопия дает заключение только о грибковой природе инфекции, но не о виде гриба-возбудителя.

Конечно, результативность микроскопического исследования зависит от квалификации сотрудника лаборатории.

Рис. 1. Микроскопия соскоба с ногтей, пораженных Т. rubrum. Видны гифы гриба.

КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Проводят посев материала на стандартную среду Сабуро, часто с добавками антибиотиков. В диагностике дерматофитных инфекций принято добавлять в среду Сабуро циклогексимид, подавляющий рост грибов-контаминантов, попадающих из воздуха. Существуют готовые коммерческие среды с добавками антибиотиков и циклогексимида. Следует помнить, что многие плесневые грибы-недерматофиты и некоторые виды Candida не растут на среде с циклогексимидом, поэтому рекомендуется делать посев на среду Сабуро с циклогексимидом и на среду без него. Идентификацию видов обычно проводят при микроскопическом исследовании выросшей культуры или путем пересева на селективные среды (рис. 2-15).

Рис. 2. Культура гриба Т. rubrum, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро (слева) и кукурузном агаре (справа).

Рис. 3. Культура гриба Т. mentagrophytes var. interdigitale, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 4. Культура гриба Candida albicans. Получена на среде Сабуро.

Рис. 5. Культура гриба Torulopsis glabrata, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 6. Культура гриба Ulocladium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 7. Микроморфология Acremonium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 8. Микроморфология Fusarium sp., вьщеленного из пораженных ногтей.

Рис. 9. Микроморфология Scopulariopsis sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 10. Микроморфология Candida albicans, выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 11. Микроморфология Altemaria sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 12. Микроморфология Aspergillus sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 13. Микроморфология Ulocladium sp , выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 14. Микроморфология Chaetomium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис 15. Панель питательных фед для идентификации дерматофитов (слева - культура Т rubrum, справа - Т mentagrophytes var. mterdigitale).

Слева направо: среда Сабуро, среда Бакстера, среда Христенсена, кукурузный агар

Следует учесть, что некоторые плесневые грибы, в том числе дерматофиты, в культуре вырастают медленно, за 2-3 нед.

Даже при соблюдении всех правил сбора материала, при хорошем оборудовании лаборатории и высокой квалификации ее персонала число положительных результатов культурального исследования очень невелико.

По данным зарубежной литературы, процент положительных исследований не превышает 50.
Процент положительных результатов в лучших отечественных лабораториях едва достигает 30.

Таким образом, в 2 из каждых 3 случаев онихомикоза его этиологию установить не удается.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

В 1925 г. Margaret и Deveze обнаружили, что волосы, пораженные некоторыми дерматофитами, дают характерное свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Byда. Стекло Byда состоит из сульфата бария, содержит около 9% окиси никеля; оно пропускает лучи длиной 365 нм. В качестве источника ультрафиолетовых лучей можно использовать различные приборы. Природа свечения точно не установлена. Волос продолжает светиться после гибели гриба и после попыток экстрагировать флюоресцирующий материал горячей водой или холодным раствором бромида натрия. Интенсивность и характер свечения зависят от рН раствора. Полагают, что флюоресцирующая субстанция появляется в процессе взаимодействия гриба и растущего волоса.

Свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Вуда, характерно только для волос, пораженных грибами рода Microsporum (M. canis, M. audouinii, M. ferrugineum, M. distortium, изредка M. gypseum и M. nanum), a также Trichophyton schonleinii. Волосы, пораженные микроспорумами, особенно M. canis и M. audouinii, дают наиболее яркое свечение; волосы, пораженные Т. schonleinii, имеют тусклую зеленоватую флюоресценцию.

Свечение наблюдается только в полностью пораженных грибом волосах. Его может не быть в свежих очагах поражения. В этих случаях следует эпилировать волосы из краевой, наиболее активной зоны, и свечение можно обнаружить в корневой части волос.

Люминесцентный метод можно использовать как для диагностики и контроля за эффективностью лечения у отдельных больных, так и в эпидемиологических очагах. Компактные передвижные установки удобны для обследования контактных людей в школах, детских садах и т. п.

Люминесцентное обследование необходимо производить в затемненной комнате, очаги поражения должны быть предварительно очищены от корок, остатков мази и т. п. Люминесцентный метод можно использовать для диагностики отрубевидного лишая, особенно при локализации очагов поражения на волосистой части головы. Очаги поражения при этом заболевании имеют красновато-желтое или бурое свечение. Это свечение, однако, не является строго специфичным, так как может наблюдаться при наличии перхоти на волосистой части головы и даже у здоровых людей в области устьев волосяных фолликулов на лице и верхней части туловища. Выявленные с помощью люминесцентного метода пораженные волосы должны обязательно подвергаться микроскопическому исследованию.

ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы исследования используют для выявления специфической перестройки организма и серологической диагностики грибковых заболеваний. Для обнаружения специфических антител в сыворотке пробы проводят следующие серологические реакции: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции с соответствующими антигенами.

Аллергическое состояние организма больного выявляют с помощью аллергических кожных проб. Аллергены наносят на скарифицированную кожу по Пирке или втиранием в кожу по Моро, внутрикожно по Манту, а также уколом в кожу. С помощью этих проб выявляют аллергические реакции как немедленного, так и замедленного типа, что позволяет оценить состояние гуморального и клеточного иммунитета.

Для выявления специфической сенсибилизации лимфоцитов используют реакции дегрануляции базофилов, агломерации и альтерации, тест бластной трансформации, подавления миграции макрофагов и т. п.

Сопоставление результатов серологических и аллергических реакций оказывается полезным как для диагностики, так и для прогноза течения микозов.

Биологический метод. Используется для лабораторной диагностики глубоких и особо опасных микозов. Основан на заражении животных патологическим материалом от больного или культурой исследуемого гриба. Осуществляется в специальных лабораториях.

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Гистология микозов кожи, обусловленных дерматофитами

Патоморфологические изменения в очагах поражения обусловлены внедрением грибов в роговой слой эпидермиса, волосы и ногти и ответной воспалительной реакцией кожи, которая может быть острой, подострой или хронической. Диагноз можно считать установленным только в том случае, если в гистологических препаратах обнаруживают элементы грибов. Для этого используют различные гистологические окраски, наиболее информативной является периодическая кислотная реакция (PAS), позволяющая выявить полисахариды, имеющиеся в целлюлозе и хитине клеточной стенки большинства дерматофитов (окраска по Шифу и ее модификации). Можно также использовать реакции сульфатирования и импрегнацию гистологических срезов серебром [Хмельницкий О. К., 1973; Lewer W. F. и Schaumburg-Lewerl.,1983].

Грибы в роговом слое эпидермиса, даже при использовании специальных окрасок, выявляются в небольшом количестве в виде нитей мицелия и спор. В редких случаях, когда грибов в очагах поражения много, их можно обнаружить в срезах, окрашенных гемотоксилин-эозином, в виде нежных базофильных структур в роговом слое.

Воспалительные изменения в эпидермисе могут быть различными: от незначительного внутри- и внеклеточного отека шиповатых клеток до выраженного спонгиоза. Спонгиоз обычно развивается при дисгидротических вариантах микозов стоп и кистей, клинически в этих случаях отмечаются пузырьки. Причиной этой реакции обычно является Т. mentagrophytes var. interdigitale. Иногда в эпидермисе отмечается выраженный гиперкератоз, что чаще всего наблюдается при микозе, обусловленном Т. rubrum.

Гистологические изменения в дерме неспецифичны и соответствуют острому, подострому и хроническому воспалению.

При микозе гладкой кожи, вызванном Т. rubrum, грибы иногда выявляются в пушковых волосах и волосяных фолликулах. Вокруг фолликулов развивается воспалительная реакция, которая за счет попадания в дерму грибов может приобретать гранулематозный характер. Центральная часть инфильтрата в этих случаях может подвергаться нагноению и некрозу, а периферическая состоять из лимфоцитов, гистоцитов, эпителиоидных и многоядерных гигантских клеток, внутри которых иногда обнаруживаются споры гриба. Размеры спор здесь достигают 6 мкм в диаметре, в волосе обычно не превышают 2 мкм.

При инфильтративно-нагноительной форме микозов волосистой части головы и области роста бороды и усов элементы грибов обнаруживаются в волосяном фолликуле, внутри и вокруг волоса. В волосе они определяются чуть выше зоны начала кератинизации (примерно на уровне 30 мкм). В дерме отмечают воспалительную реакцию различной интенсивности, наиболее выраженную при kerion Celsii. При острой гнойной реакции в составе инфильтрата отмечают большое количество нейтрофильных лейкоцитов, элементы грибов в этом случае могут полностью исчезать. При хроническом течении процесса инфильтрат может приобретать гранулематозный характер, в нем появляются многоядерные гигантские клетки. Для подтверждения диагноза при отсутствии в инфильтрате грибов можно использовать иммунофлюоресцентные методы окраски. Для этих целей применяют меченную флюоресцином антисыворотку к Т. mentagrophytes, которая позволяет обнаружить антигены гриба в волосе и в перифолликулярном инфильтрате.

Формирование инфильтративно-нагноительной реакции кожи при микозе волосистой части головы (kerion Celsii) и области роста бороды и усов, обусловленных грибами М. саnis, Т. tonsurans и Т. verrucosum, представляет собой проявление иммунологической реакции. Об этом свидетельствуют:

1. Склонность очагов поражения к спонтанному разрешению.

2. Отсутствие элементов гриба при очень выраженной воспалительной реакции со стороны кожи при микозе, вызванном Т. verrucosum (faviforme) и Т. tonsurans.

3. Постоянная положительная реакция в ответ на внутрикожное введение трихофитина при инфильтративно-нагноительных формах микоза, вызванного зоофильными трихофитинами (например, Т. tonsurans), и отрицательная - при поверхностных микозах, обусловленных тем же Т. tonsurans.

При фавусе в роговом слое эпидермиса обнаруживается большое количество нитей мицелия и единичные споры гриба. Скутула представлена экссудатом, паракератотическими клетками эпидермиса, клетками воспалительного инфильтрата, а также нитями мицелия и спорами гриба, которые расположены преимущественно в периферической зоне скутулы. В активной стадии болезни в дерме вокруг дегенеративных волосяных фолликулов отмечается выраженный воспалительный инфильтрат, содержащий многоядерные гигантские и плазматические клетки. В старых очагах поражения волосы и сальные железы отсутствуют, имеются явления фиброза.

Гистология микозов кожи и слизистых оболочек, обусловленных дрожжеподобными грибами

При кандидозе кожи и слизистых оболочек грибы рода Candida обнаруживаются в роговом слое эпидермиса или в поверхностных слоях эпителия слизистой оболочки. Элементов гриба обычно мало, они хорошо окрашиваются PAS-peакцией или по Граму; представлены в виде нитей септированного ветвящегося мицелия, размером 2-4 мкм в диаметре, или овоидными спорами, размером 3 - 5мкм в диаметре. Диагностическое значение имеет обнаружение мицелиальной формы гриба.

При гистологическом исследовании хронического гранулематозного кандидоза кожи и слизистых оболочек элементы гриба также преимущественно обнаруживают в роговом слое эпидермиса или в самых верхних отделах эпителия слизистой оболочки, но иногда в шиповатом слое, внутри волоса и в дерме. Отмечается также выраженный гиперкератоз и папилломатоз; в дерме – густой воспалительный инфильтрат, состоящий из лимфоидных клеток, нейтрофилов, плазматических и многоядерных гигантских клеток. Инфильтрат может распространяться в подкожную жировую клетчатку.

При отрубевидном лишае в роговом слое эпидермиса обнаруживают большое количество элементов гриба в виде нежных базофильных структур, которые хорошо видны даже при окраске препаратов гемотоксилин-эозином. Грибы представлены как нитями, так и спорами.

При фолликулярной форме отрубевидного лишая отмечается скопление роговых масс и клеток воспалительного инфильтрата в расширенных устьях волосяных фолликулов. Вокруг фолликулов также отмечают воспалительный инфильтрат. При PAS-реакции сферические или овальные споры гриба, размером 2-4 мкм в диаметре, обнаруживают внутри устья волосяных фолликулов, а иногда в перифолликулярном инфильтрате. Мицелий никогда не выявляется.

Нарушение пигментации кожи у больных отрубевидным лишаем обусловлено способностью гриба Pityrosporum вырабатывать субстанцию, которая угнетает процесс пигментообразования в эпидермисе. Электронно-микроскопическое изучение биоптатов кожи с гипопигментированных участков показало, что в меланоцитах образуются очень маленькие меланосомы, которые не способны проникать в кератиноциты. В гиперпигментированных участках кожи, наоборот, меланосомы крупные и содержат большое количество меланина.

Клиническая картина грибковых заболеваний кожи весьма полиморфна, поэтому во всех случаях диагноз должен быть подтвержден лабораторными методами исследования. Для лабораторной диагностики микозов используют микроскопический, люминесцентный, культуральный, иммунологический (аллергологический и серологический) методы исследования, а также эксперименты на животных.

Лабораторная диагностика микозов складывается из нескольких этапов. В обычной клинической практике обычно ограничиваются микроскопическим и культуральным исследованием зараженного материала. При необходимости эти методы дополняются иммунологическими, гистологическими исследованиями, заражением экспериментальных животных. При некоторых микозах кожи важную вспомогательную роль в диагностике играет люминесцентный метод.

Взятие патологического материала.

Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала. Поскольку грибы способны поражать различные органы человека, при подозрении на микоз необходимо исследовать различный патологический материл. В дерматологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат кожные чешуйки, волосы, ногти. При подозрении на глубокие и системные микозы может возникнуть необходимость лабораторной диагностики на грибы мокроты, промывных вод, мочи, фекалий, гноя, отделяемого слизистых оболочек, крови, кусочков органов и биопсированной ткани.

В очагах поражения на коже, из которых предполагается брать патологический материал, за несколько дней или недель необходимо прекратить всякое лечение. Следует иметь в виду, что использование слабых дезинфицирующих растворов или даже индифферентных средств может помешать исследованию. Непосредственно перед забором патологического материала очаг поражения необходимо обработать 96% спиртом или раствором ксилола. Материал лучше всего брать со свежих, но уже полностью развившихся очагов поражения. Кожные чешуйки необходимо соскабливать с периферии очагов, грибы здесь встречаются чаще всего как в виде мицелия, так и спор. Кожные чешуйки снимаются скальпелем, корочки - эпиляционным пинцетом.

У больных микозами волосистой части головы пораженные волосы извлекают эпиляционным пинцетом. Для исследования необходимо брать короткие, перекрученные, изогнутые в виде дуги или запятой, а также длинные, но покрытые чехлом в основании, волосы. При подозрении на фавус необходимо помнить о том, что волосы не обламываются, но становятся тусклыми, безжизненными, седоватыми.

Соскобы с поверхностных очагов пораженных ногтевых пластинок делают скальпелем, утолщенные ногтевые пластинки срезают скальпелем или маникюрными кусачками.

Жидкий патологический материал собирают асептично в стерильную посуду, чешуйки кожи, ногтя и волосы – на листочки простой или мягкой пергаментной бумаги.

Отделяемое со слизистых оболочек для посева берут тампоном из гигроскопической ваты, который затем помещают в сухую стерильную пробирку или пробирку с 2 мл питательной среды (сусло Сабуро). Материал из влагалища получают из заднего свода; с головки полового члена – из области венечной борозды.

Материал из наружного слухового прохода берут петлей или тампоном, который помещают в пробирку.

Поступивший в лабораторию материал исследуют в течение 1 ч после взятия при хранении в условиях комнатной температуры или не более чем через 3 ч при хранении в холодильнике при температуре 4 °С.

Кровь для исследования на грибы берут из локтевой вены в количестве 5 – 10 мл и вносят сразу с колбочку с жидкой питательной средой или равным количеством цитрата натрия.

При необходимости исследования на грибы биопсийного материала его помещают в стерильную чашечку Петри и используют для микроскопии, посевов на питательные среды и приготовления гистологических препаратов.

Микроскопическое исследование.

Микроскопическое исследование патологического материала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах. Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем самым делают грибы доступными для исследования.