Реакция непрямой гемагглютинации (рнга), или реакция пассивной гемагглютинации (рпга). Серологические реакции в диагностике инфекционных болезней Реакция обратной непрямой гемагглютинации

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.

1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного приме­няются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорби­рован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отноше­нии этой реакции чаще употребляют термин РПГА.

Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых план­шетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положитель­ной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кру­жевного зонтика», при отрицательной реакции - плотный осадок эрит­роцитов в виде "пуговки".

2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исс­ледуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагнос­тикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В от­ношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген па­лочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.

Реакция Кумбса (аптиглобулиновый тест)

Реакцию применяют для выявления неполных антител, например, антител к резус-фактору. К Rh + эритроцитам добавляют исследуемую сыворотку, в которой предполагается присутствие неполных антител к резус-фактору. Присоединившись к эритроцитам, неполные антите­ла не вызывают агглютинации, так как имеют только один активный центр. Затем добавляют антиглобулиновую сыворотку, содержащую антитела к глобулинам человека. Соединившись с неполными антите­лами, антиглобулиновая сыворотка вызывает агглютинацию эритроци­тов.

Реакция преципитации

Сущность реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена под действием специфических антител. Для получения видимой реак­ции необходимо присутствие электролита. Антигеном в реакции пре­ципитации являются молекулярно-дисперсные вещества.

Реакция кольцепреципитации ставится в узких преципитационных пробирках. В пробирку наливают иммунную сыворотку, на нее осто­рожно наслаивают исследуемый материал. При наличии в нем антигена на границе двух жидкостей образуется непрозрачное кольцо преципи­тата.

Реакцию применяют в судебной медицине для определения видо­вой принадлежности белков в кровяных пятнах, в сперме и т.д.; для определения антигена при диагностике сибирской язвы (реакция Асколи), менингита и других инфекций; в санитарно-гигиенических ис­следованиях - для установления фальсификации пищевых продуктов. Иммунные преципитирующие сыворотки получают путем иммуниза­ции животных соответствующим антигеном. Например, сыворотка, преципитирующая белок человека, получена путем иммунизации кро­лика белком человека. Титр преципитирующей сыворотки - это наи­большее разведение антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5.

Реакция преципитации в агаровом геле проводится несколькими ме­тодами. Это реакция двойной иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии, реакция иммуноэлектрофореза.

Реакция двойной иммунодиффузии (по Оухтерлони). Растопленный агаровый гель выливают в чашку Петри и после затвердевания в нем вырезают лунки. В одни лунки помещают антиген, в другие - иммун­ные сыворотки, которые диффундируют в агар, образуют в месте встре­чи преципитат в виде белых полос.

Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини). В растоп­ленный агаровый гель вносят иммунную сыворотку, выливают в чашку. После застывания агара в нем вырезают лунки и помещают в них антигены, которые, диффундируя в агар, образуют кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Чем выше концентрация антиге­на, тем больше диаметр кольца. Реакцию применяют, например, для определения в крови иммуноглобулинов различных классов. Иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA действуют в этой реакции как антигены, а антитела против них содержатся в специфических мо-норецепторных сыворотках.

Иммуноэлектрофорез. В агаровом геле проводят электрофорез белковых антигенов. В канавку, которая идет параллельно направ­лению движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в агар, и в месте их встречи образуются линии преципитации.

Реакции иммунного лизиса

Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфи­ческими антителами, образует иммунный комплекс, к которому при­соединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эрит­роциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериолиза применяется для идентификации холерного вибриона.

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, ан­титела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритро­цитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лако­вую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для об­наружения комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант ре­акции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.

Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют ком­племент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, об­разуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).

Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.

Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.

Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.

На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.

Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:

• фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
• обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
• сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.

Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.

Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:

• к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
• смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
• учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.

За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.

РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.

РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:

• обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
• обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.

Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)

Эта реакция по чувствительности превосходит реакцию агглютинации и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими и другими микроорганизмами.

РПГА позволяет обнаружить небольшую концентрацию антител.

В этой реакции участвуют таннизированные бараньи эритроциты или эритроциты человека с кровью I группы, сенсибилизированные антигенами или антителами.

Если в исследуемой сыворотке определяются антитела, то используются эритроциты, сенсибилизированные антигенами (эритроцитарный диагностикум).

В некоторых случаях, при необходимости определения различных антигенов в исследуемом материале, используют эритроциты, сенсибилизированные иммунными глобулинами.

Результаты РПГА учитывают по характеру осадка эритроцитов.

Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки (перевернутый зонтик).

При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска (пуговка) располагаются в центре дна пробирки.

Реакция агглютинации (РА)

Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля) и др.

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы - агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.

Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) - специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) - неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.

Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О- антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 - 22 часов.

У жгутиковых микробов имеются два антигена - соматический О- антиген и жгутиковый Н- антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 - 4 часов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя. гемагглютинация микробиологический инфекционный

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой, разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

Занятие 14

Тема: Непрямые серологические реакции. Реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), связывания комплемента (РСК).

Антитела

Антителами называются белковые молекулы, способные к специфическому связыванию с антигенами . Антитела относятся к гамма-глобулинам. Другое название антител – иммуноглобулины. У млекопитающих существует 5 классов иммуноглобулинов, различающихся по своему строению и некоторым свойствам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Строение иммуноглобулинов . Наиболее “типичное” строение имеют IgG. Молекула состоит из 4 белковых цепей: двух легких (L) и двух тяжелых (H), которые соединены между собой дисульфидными связями. Участок антитела, который связывается с антигеном, называется активным центром антитела. В молекуле IgG имеется 2 активных центра. Он образован N-концевыми участками тяжелой и легкой цепей. Участок тяжелых цепей, расположенный вблизи дисульфидных связей, называется шарнирной областью. С помощью фермента папаина молекула IgG выше шарнирной области расщепляется на 3 фрагмента: 2 из них содержат легкую цепь и часть тяжелой цепи (Fab-фрагменты); а третий фрагмент состоит только из части тяжелых цепей (Fc-фрагмент). Благодаря подвижной шарнирной области Fab-фрагменты могут изменять взаимное расположение в пространстве.

Аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей делятся на константные (постоянные) и вариабельные участки. Вариабельные участки находятся на N-концах легких и тяжелых цепей (VL и VH). Константные участки находятся на С-концах цепей (СL и СH). В легких и тяжелых цепях аминокислотные последовательности образуют несколько глобулярных структур, которые называются доменами.

Активный центр антитела образуется вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей и представляет собой полость (паратоп ), имеющую определенную конфигурацию и распределение электрических зарядов на своей поверхности. Размер, форма и распределение зарядов в активном центре определяет его специфичность, то есть способность связываться с определенной антигенной детерминантой (эпитопом ), имеющей комплементарную структуру.

Антигенные детерминанты представляют собой участки, выступающие на поверхности молекул антигенов. Поэтому взаимодействие эпитоп-паратоп происходит по принципу “ключ-замок”.

Прочность связи активного центра антител с антигенной детерминантой характеризуется понятием аффинность. Аффинность – это мера сродства активного центра и антигенной детерминанты.

На долю иммуноглобулинов класса IgG приходится 75% от общего количества сывороточных имуноглобулинов. Важным свойством IgG является их способность проходить через плаценту. Таким образом, материнские антитела попадают в организм ребенка и защищают его в первые месяцы жизни от инфекции (естественный пассивный иммунитет).

К классу IgM относится около 10% общего пула иммуноглобулинов. Молекула IgM представляет собой пентамер, то есть состоит из 5 одинаковых молекул, сходных по своему строению с молекулой IgG, имеет 10 активных центров. Субъединицы соединены между собой дисульфидными связями. В молекуле IgM имеется дополнительная J-цепь, которая связывает субъединицы. Антитела класса IgM не проходят через плацентарный барьер.

Антитела класса IgА составляют 15-20% от общего содержания иммуноглобулинов. Молекула IgА состоит из 2-х легких и 2-х тяжелых цепей, имеет 2 активных центра. В сыворотке крови IgА присутствуют в мономерной форме, тогда как в секретах слизистых оболочек IgА представлены в виде димеров и называются секреторными или sIgА, имеют 4 активных центра. С-концы тяжелых цепей в молекуле sIgА соединены между собой J-цепью и белковой молекулой, которая называется секреторный компонент. Секреторный компонент защищает sIgА от расщепления протеолитическими ферментами, которые содержатся в большом количестве в секрете слизистых оболочек. Основная функция sIgА – защита слизистых оболочек от инфекции. IgА не проникают через плацентарный барьер. Высокая концентрация sIgА обнаруживается в женском грудном молоке, особенно в первые дни лактации. Они защищают желудочно-кишечный тракт новорожденного от инфекции.

IgD в основном находятся на мембране В-лимфоцитов. Имеют строение, подобное IgG, 2 активных центра. Биологическая роль до конца не известна.

IgЕ – концентрация этого класса иммуноглобулинов в сыворотке крови чрезвычайно низкая. Молекулы IgЕ в основном фиксированы на поверхности тучных клеток и базофилов. По своему строению IgЕ сходен с IgG, имеет 2 активных центра. Предполагается, что IgЕ имеет существенное значение в развитии антигельминтозного иммунитета. IgЕ играет главную роль в патогенезе некоторых аллергических заболеваний (бронхиальная астма , сенная лихорадка) и анафилактического шока.

Реакция непрямой гемагглютинации

В непрямых серологических реакциях комплекс антигенов с антителами не виден невооруженным глазом. В таких случаях антигены адсорбируют на более крупных частицах-носителях (эритроцитах, частицах латекса), получая антигенный эритроцитарный диагностикум. Последующая агглютинация специфическими антителами таких частиц позволяет видеть агглютинат (осадок) невооруженным глазом. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) выявляет антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.

Эритроциты с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.

РНГА ставят в пластиковых планшетах или в пробирках с разведениями сыворотки крови, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум – эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Такую реакцию называют РОНГА – реакцией обратной непрямой гемагглютинации.

Компоненты РНГА:

Сыворотка крови больного (разведение 1:25);

Эритроцитарный диагностикум (эритроциты, нагруженные антигеном исследуемого возбудителя);

Промывной раствор.

Постановка РНГА. В семь лунок планшета для иммунологических исследований вносят по две капли фосфатного буферного раствора. В первую лунку прибавляют две капли сыворотки крови больного, после чего из первой лунки переносят 2 капли во вторую лунку, из второй – в третью и т. д. Из шестой лунки 2 капли удаляют. Во все семь лунок (6 опытных и 1 контрольную) прибавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе. Планшеты оставляют при комнатной температуре на 45 минут, после чего учитывают результаты.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента заключается в том, что при соединении антигена с антителом образуется иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент. Если комплекс антигена с антителом не образуется, то комплемент остается свободным. Свободный комплемент выявляется добавлением к смеси гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и антител против них. Положительная реакция – отсутствие гемолиза в результате связывания комплемента с комплексом антиген+антитело. Отрицательная реакция – наличие гемолиза в результате связывания комплемента с комплексом эритроцит+антиэритроцитарное антитело.

Компоненты РСК:

Сыворотка крови здорового;

Сыворотка крови больного (в разведении 1:5);

Антигенный компонент реакции - инактивированный возбудитель;

Комплемент в разведении, соответствующем рабочей дозе. Комплемент получают из сыворотки крови морской свинки. Титром комплемента является его минимальная доза, которая в присутствии гемолитической сыворотки вызывает полный гемолиз эритроцитов. Рабочая доза комплемента, используемая при постановке РСК, на 30% больше его титра;

Гемолитическая система - взвесь эритроцитов барана, обработанных кроличьими антителами к эритроцитам барана.

Промывочный раствор.

Постановка РСК. РСК ставят в двух пробирках – опытной и контрольной. В опытную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови больного, в контрольную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови здорового донора, в обе пробирки вносят по 0,5 мл лизата возбудителя, а также по 0,5 мл комплемента. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе. Пробирки помещают в термостат при температуре 37°С на 30 минут. После инкубации в обе пробирки вносят по 1,0 мл гемолитической системы. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 30 минут. При положительной реакции в опытной пробирке отмечается задержка гемолиза (жидкость бесцветная и осадок эритроцитов), в контрольной пробирке – гемолиз эритроцитов.

Литература для подготовки к занятию:

1. Борисов микробиология, вирусология , иммунология. М., 2002.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. . М., 2004.

3. Поздеев микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

Реакции агглютинации основаны на взаимодействии реагента (антител) с антигенами, находящимися на поверхности клеток или инородных частиц. В результате образуются агрегаты крупного размера, которые выпадают в осадок и их можно увидеть даже невооруженным глазом. Таким образом определяют группу крови по системе АВО, наличие в ней резус-фактора и др. Это более чувствительный по сравнению с реакциями преципитации способ диагностики, так как объем осадка (агглютината) превосходит объем преципитата.

Прямая гемагглютинация

Непрямая гемагглютинация